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Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒
点击次数:107 发布时间:2018-10-26

Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit

Cat No. 40302

 

产品说明书

本产品仅作科研用途!

产品信息

 

产品名称

货号

规格

储存

 

40302ES20

20T

4℃避光保存

Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit

Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒

40302ES50

50T

4℃避光保存

 

40302ES60

100T

4℃避光保存

产品描述

 

Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit是用 FITC 标记了的 Annexin V 作为探针,来检测细胞早期凋亡的发生,可用荧光显微镜、流式细胞仪或其他荧光检测设备进行检测。

其检测原理为:在正常的活细胞中,磷脂酰丝氨酸phosphotidylserinePS位于细胞膜的内侧,但在早期凋亡的细胞中,PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ(膜联蛋白-V是一种分子量为 35-36KD Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白,能与PS 高亲和力结合。可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

另外,本试剂盒中还提供了碘化丙啶(Propidium IodidePI)用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。PI 一种核酸染料,它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜,但可以透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜而使细胞核染红。因此,将 Annexin V PI 联合使用时,PI 则被排除在活细胞Annexin V-/PI-和早期凋亡细胞Annexin V+/PI-之外,而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被 FITC  PI  结合染色呈现双阳性Annexin V+/PI+)。

产品组分

编号 组分

产品编号/规格

运输与保存方法

冰袋(wet ice)运输。本试剂盒中所有组分均在 4℃保存,勿冻存Annexin V-FITCPI 需避光保存。一年有效。

注意事项

 

1) 由于细胞凋亡是一个快速的过程,建议样品在染色后 1 小时之内进行分析。

  • 对于贴壁细胞,消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞,需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。胰酶消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,PI 摄入过多;消化时间过长,细胞膜同样易造成损伤,甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与 Annexin V-FITC 的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后,轻摇时胰酶与细胞充分接触,然后倒掉大部分胰酶,利用剩余的少量胰酶再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用 EDTAEDTA 会影响 Annexin

V PS 的结合。

3) 实验中如需要固定细胞,比如在检测凋亡的同时检测细胞周期,只能选用Annexin V-FITC,而不能选用Annexin V-EGFP因为在固定过程中 EGFP 会变性导致丧失激发荧光的能力。固定前需要先将细胞与 Annexin V-FITC 进行孵育,并用binding buffer 洗掉未结合的 Annexin V-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加会产生细胞碎片,可以和 Annexin V 结合,对结果产生干扰。

4) 如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有 PS,能与 Annexin  V 结合,从而干扰实验结果。可以使用含有 EDTA 的缓冲剂并在 200 g 离心洗去血小板。

5) 试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。

6) Annexin V-FITC PI 是光敏物质,在操作时请注意避光。

操作方法

1.1 样品染色

1. 悬浮细胞:300g4℃离心 5 min 收集细胞。贴壁细胞:用不含 EDTA 的胰酶消化后,300g4℃离心 5 min 收集细胞。胰酶消化时间不宜过长,以防引起假阳性。

2. 用预冷的PBS 洗涤细胞 2 次,每次均需 300g4℃离心 5 min。收集 15×10 5 细胞。

3. 加入 100μl 1×Binding Buffer 重悬细胞。

4. 加入 5μl Annexin V-FITC 5μl PI Staining Solution,轻轻混匀。

5. 避光、室温反应 10 min

6.  加入 400μl 1×Binding Buffer,混匀,样品在 1 小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。注:为了避免洗涤细胞时损失细胞,在吸液时可以用大的 Tip 头套上小的 Tip 头吸液。

1.2 样品分析

A. 流式细胞仪分析:

FITC 最大激发波长为 488 nm,最大发射波长 525 nmFITC 的绿色荧光在 FL1 通道检测;PI-DNA 复合物的最大激发波长535 nm,最大发射波长为 615 nmPI 的红色荧光在 FL2 FL3 通道检测。用 CellQuest 等软件进行分析,绘制双色散点two-color dot plotFITC 为横坐标,PI 为纵坐标。每个样采集 10000 events。典型的实验中,细胞可以分成三个亚群,活细胞仅有很低强度的背景荧光,早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光,晚期凋亡细胞有绿色和红色荧光双重染色。

B. 荧光显微镜分析:

1) 滴一滴用 Annexin V-FITC/PI 双染的细胞悬液于载玻片上,并用盖玻片盖上细胞。注:对于贴壁细胞,可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡。

2) 在荧光显微镜下用双色滤光片观察。Annexin V-FITC 荧光信号呈绿色,PI 荧光信号呈红色。

 

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