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CCK-8试剂盒的操作说明和注意事项介绍
点击次数:343 发布时间:2018-08-27
  Cell Counting Kit-8,简称CCK-8试剂盒,是一种基于WST-8而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测试剂盒。CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中,不需要预配各种成分。WST-8在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快,则颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅。对于同样的细胞,颜色的深浅(生成的formazan量)和细胞数目呈线性关系
  CCK-8试剂盒操作说明
  CCK-8试剂盒可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测,也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测,或一些药物诱导的细胞生长抑制检测。
  1.制作标准曲线
  a.先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,然后接种细胞;
  b.按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般要做5-7个细胞浓度梯度,每组4-6个复孔;
  c.接种后培养2-4小时使细胞贴壁,然后每100霯培养基加10霯 CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值,制作出一条以细胞数量为横坐标,OD值为纵坐标的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量。使用此标准曲线的前提条件是试验条件完全一致。
  2.细胞活性检测
  a.在96孔板中接种细胞悬液(100霯/孔),将培养板放在培养箱中预培养24小时;
  b.向每孔加入10霯的CCK-8溶液(注意不要产生气泡);
  c.将培养板置于培养箱内孵育1-4小时;
  d.用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
  3.细胞增殖-毒性检测
  a.在96孔板中接种细胞悬液(100霯/孔),将培养板放在培养箱中预培养24小时;
  b.向培养板加入不同浓度的待测药物;
  c.将培养板在培养箱孵育一段适当的时间;
  d.向每孔加入10霯的CCK-8溶液(注意不要产生气泡);
  e.将培养板置于培养箱内孵育1-4小时;
  f.用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
  CCK-8试剂盒注意事项
  1.CCK-8的培养时间一般为1-4小时,但在培养30分钟左右即可取出肉眼观察显色程度,根据细胞种类而定,需要摸索条件,CCK-8的*佳反应时间以具体显色的*佳时间为准。
  2.使用96孔板进行检测时,如果细胞培养时间较长,一定要注意蒸发问题。一方面,由于96孔板周围一圈*容易蒸发,可以采取弃用周围一圈的办法,改加相同量的PBS、水或培养液;另一方面,可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方,以缓解蒸发。
  3.本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应,所以还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测,如果待检测体系中存在较多的还原剂,需设法去除。用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡,否则会干扰测定。
  4.加入药物中如含有金属,对CCK-8显色有影响。终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应,使灵敏度降低。如果终浓度是10 mM的话,将会100%抑制。
  5.培养基中的酚红不会影响实验结果,酚红的吸光度可以在计算时,通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响。
  6.本产品可以检测,但不能检测酵母细胞。向100霯培养液中加入10霯 CCK-8溶液,并培养1-4小时或过夜。
  7.CCK-8试剂盒对细胞的毒性非常低。它和活细胞内的脱氢酶持续反应使溶液颜色不断加深,OD值不断增加(注:活细胞内的脱氢酶是持续产生的)。
  8.要测定细胞的具体数量,建议同时做标准曲线。
  9.建议采用多通道移液器,以减小平行孔间的差异。
  10.以下方法可以终止CCK-8反应(96孔板):
  (a).在显色反应后,将培养板放置4°C冰箱内
  (b).每孔加10霯 0.1 M HCl溶液
  (c).每孔加10霯 1%(w/v)的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液
  CCK-8试剂盒注意:反应停止后,应在24小时内测定。
  11.本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品。
  12.为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
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